CRISPR/Cas9核酸酶表達載體是當前幾種流行的基因編輯工具之一，可以快速有效地在基因組靶序列上創(chuàng)造突變（其它兩種常見的工具是ZFN和TALEN）。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細菌產生對質粒和噬菌體等外源遺傳物質的抵抗能力。在細胞內，Cas9核酸酶與引導RNA（gRNA）形成復合物，該復合物通過與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點通過互補配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。

使用CRISPR打靶目的基因需要目標細胞同時表達Cas9和特異gRNA。這可以通過在同一個載體上共表達Cas9和gRNA，也可以通過在兩個載體各上自表達Cas9和gRNA來實現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個載體分開表達的優(yōu)勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如Cas9n，dCas9），從而帶來更多變的實驗方案。

我們的常規(guī)Cas9表達質粒載體可以直接轉染哺乳動物細胞，方法如同大多數(shù)實驗室的傳統(tǒng)轉染方法一樣，操作上非常簡便。質粒轉染要注意的是，這種方法屬于瞬時轉染，只有極小一部分的細胞中的質粒序列會穩(wěn)定整合到細胞基因組中（整合幾率的典型值小于1%）。

我們提供多種版本的來源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。這其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，只對靶序列的DNA單鏈造成切口；dCas9，包含D10A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和性強化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強化的SpCas9。dCas9融合轉錄激活結構域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉錄抑制結構域后，如dCas9/KRAB，可分別應用于CRISPRa和CRISPRi系統(tǒng)。此外，我們提供的來源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統(tǒng)。AsCpf1造成DSB時，兩條DNA鏈上的切口位置相互錯開，形成粘性末端）。

點擊此處查看我們提供的Cas9類型

關于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

我們的Cas9表達載體可使用用戶自定義的啟動子實現(xiàn)Cas9蛋白的高水平表達。我們提供多種類型的Cas9蛋白以滿足不同的實驗需求。Cas9表達載體系統(tǒng)已經過優(yōu)化，其在大腸桿菌中具有高拷貝復制能力，且對細胞具有高效轉染率。根據(jù)用戶選擇的篩選標記基因，可對轉染了該載體的細胞進行篩選或者可視化追蹤。

瞬時表達：轉染Cas9表達質粒載體可以在靶細胞中獲得高水平的Cas9蛋白表達瞬時峰值。在無藥篩的情況下，基因編輯完成后Cas9質粒載體會逐漸從細胞中丟失。

靈活性：Cas9表達質粒載體可與多種不同的gRNA共轉染至細胞中以打靶多個位點。

技術簡單：常規(guī)轉染即可把質粒轉入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。

高水平表達：常規(guī)質粒轉染細胞后，可以產生非常高的拷貝數(shù)（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能高水平表達。

載體DNA非整合型：常規(guī)質粒在細胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質粒轉染也稱為瞬時轉染。然而，質粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染每10²~10⁶個細胞可能會有一個細胞的基因組被整合，整合效率取決于細胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標記基因的載體轉到細胞中，在經過擴大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得穩(wěn)定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型更是難以轉染，如神經元和胰島β細胞。另外，質粒轉染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數(shù)在不同細胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉染可以在單個細胞里產生非常高的拷貝數(shù)，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒有。而病毒轉導更傾向于相對均勻地把基因轉到細胞中。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向特定位點時對gRNA識別序列3'端的PAM序列有嚴格要求。不同類型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

CRISPR/Cas9核酸酶表達載體是當前幾種流行的基因編輯工具之一，可以快速有效地在基因組靶序列上創(chuàng)造突變（其它兩種常見的工具是ZFN和TALEN）。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細菌產生對質粒和噬菌體等外源遺傳物質的抵抗能力。在細胞內，Cas9核酸酶與引導RNA（gRNA）形成復合物，該復合物通過與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點通過互補配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。

使用CRISPR打靶目的基因需要目標細胞同時表達Cas9和特異gRNA。這可以通過在同一個載體上共表達Cas9和gRNA，也可以通過在兩個載體各上自表達Cas9和gRNA來實現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個載體分開表達的優(yōu)勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如Cas9n，dCas9），從而帶來更多變的實驗方案。

我們的常規(guī)Cas9表達質粒載體可以直接轉染哺乳動物細胞，方法如同大多數(shù)實驗室的傳統(tǒng)轉染方法一樣，操作上非常簡便。質粒轉染要注意的是，這種方法屬于瞬時轉染，只有極小一部分的細胞中的質粒序列會穩(wěn)定整合到細胞基因組中（整合幾率的典型值小于1%）。

我們提供多種版本的來源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。這其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，只對靶序列的DNA單鏈造成切口；dCas9，bao'hanD10A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和性強化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強化的SpCas9。dCas9融合轉錄激活結構域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉錄抑制結構域后，如dCas9/KRAB，可分別應用于CRISPRa和CRISPRi系統(tǒng)。此外，我們提供的來源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統(tǒng)。AsCpf1造成DSB時，兩條DNA鏈上的切口位置相互錯開，形成粘性末端）。

點擊此處查看我們提供的Cas9類型

關于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

我們的Cas9表達載體可使用用戶自定義的啟動子實現(xiàn)Cas9蛋白的高水平表達。我們提供多種類型的Cas9蛋白以滿足不同的實驗需求。Cas9表達載體系統(tǒng)已經過優(yōu)化，其在大腸桿菌中具有高拷貝復制能力，且對細胞具有高效轉染率。根據(jù)用戶選擇的篩選標記基因，可對轉染了該載體的細胞進行篩選或者可視化追蹤。

瞬時表達：轉染Cas9表達質粒載體可以在靶細胞中獲得高水平的Cas9蛋白表達瞬時峰值。在無藥篩的情況下，基因編輯完成后Cas9質粒載體會逐漸從細胞中丟失。

靈活性：Cas9表達質粒載體可與多種不同的gRNA共轉染至細胞中以打靶多個位點。

技術簡單：常規(guī)轉染即可把質粒轉入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。

高水平表達：常規(guī)質粒轉染細胞后，可以產生非常高的拷貝數(shù)（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能高水平表達。

載體DNA非整合型：常規(guī)質粒在細胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質粒轉染也稱為瞬時轉染。然而，質粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染每10²~10⁶個細胞可能會有一個細胞的基因組被整合，整合效率取決于細胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標記基因的載體轉到細胞中，在經過擴大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得穩(wěn)定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型更是難以轉染，如神經元和胰島β細胞。另外，質粒轉染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數(shù)在不同細胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉染可以在單個細胞里產生非常高的拷貝數(shù)，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質粒拷貝數(shù)非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒有。而病毒轉導更傾向于相對均勻地把基因轉到細胞中。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向特定位點時對gRNA識別序列3'端的PAM序列有嚴格要求。不同類型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.